СВЯЗЬ СИНТЕЗОВ С ЭЛЕКТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ.
МОДЕЛЬ Б. Н. ВЕПРИНЦЕВА И ЕЕ АЛЬТЕРНАТИВА
Пик интереса Бориса Николаевича к разработке этой проблемы приходится на начало 70-х. Его представления о механизме такой связи были простыми и четкими. Основное проявление возбуждения нервной клетки – это активация электрогенной мембраны, усиленная генерация ПД. Основное следствие генерации ПД – это изменение ионного баланса в клетке. Единственный ион, концентрация которого может при этом значимо меняться, - это Са2+. Поэтому именно Са2+ влияет на интенсивность синтеза РНК: повышение концентрации Са2+ , который входит в клетку при генерации ПД, приводит к подавлению синтеза. На нормализацию концентрации Са2+ нейроны отвечают выраженной активизацией синтеза и РНК, и белка. Чем больше РНК, тем интенсивнее синтез белка. Чем больше новых белков, тем выше пластические возможности нервной клетки.
В 1973 году Борис Николаевич организовал в Пущино рабочее совещание «Клеточные механизмы памяти», на котором были подведены некоторые итоги разработки проблемы взаимозависимости электрической и метаболической активности нервных клеток. Итоги оказались не очень оптимистичными. Несмотря на все усилия, нащупать механизм, который связывает формирование памяти с синтезом РНК и белка, не удавалось. Непротиворечиво объяснить, каким образом осуществляется координация процессов, происходящих на наружной мембране, и синтеза РНК в ядре и белка в цитоплазме тоже не получалось. К этому времени сложилось два, на первый взгляд взаимоисключающих подхода. Так, Б.Н. Вепринцев отводил приоритетную роль в регуляции синтезов ПД, а именно потокам Са2+. Он допускал, что некоторые, не все, медиаторы через свои мембранные рецепторы и сопряженные с ними внутриклеточные сигнальные системы могут влиять на синтетические процессы. Но результаты экспериментов, проведенных в собственной лаборатории, поддерживали его убеждение, что только спайковая активность приводит к нарастанию синтеза РНК и белков. Только усиленная генерация ПД на время превращает нейрон в некое подобие секреторной клетки, когда цитоплазму почти целиком заполняет гранулярный эндоплазматический ретикулум. Ни де- или гиперполяризация мембраны током через введенный электрод, ни гиперполязизация адреналином к таким последствиям не проводили, а деполяризация ацетилхолином вообще ничего не меняла в ультраструктуре нейронов и не влияла на синтез РНК.
Сторонники альтернативного подхода наоборот считали, что только синаптические процессы влияют на синтезы, а ПД к этому отношения не имеют. Ее разделяло не только большинство исследователей, работавших с нервными клетками позвоночных. Так, Peterson и Kernell, опираясь на свои результаты, пришли к заключению, что сама по себе генерация ПД, без предшествующих им синаптических потенциалов, к активации синтетических процессов не приводит. Они наблюдали усиление синтеза РНК только в ответ на стимуляцию нейрона аплизии через нервы, а при прямом раздражении через введенный в клетку электрод усиления не было. Позднее Т.Л. Дьяконова тоже провела эксперимент с прямым раздражением нейронов через введенный в клетку электрод. У нее все генерировавшие только ПД нейроны включали в РНК меньше меченого уридина, чем контрольные клетки. Правда, ничего похожего на линейную зависимость включения от количества ПД не наблюдалось. Получалось, что даже при методически одинаковой постановке опытов и использовании сходных объектов полученные результаты можно было трактовать противоположным образом. Концы не связывались, задача не решалась.
Оглядываясь назад, отчетливо видно, что идея построения простой схемы регуляторных влияний электрической активности на синтетические процессы в нервных клетках изначально не имела достаточных шансов на успех. Метаболическая реакция на раздражение многокомпонентна и многофазна. Она включает в себя не только усиление, но и подавление синтеза РНК, а также изменение паттерна экспрессируемых РНК. При этом подавление синтеза не всегда переходит в его активизацию до уровня выше исходных значений. Сдвиги в содержании РНК определяются как интенсивностью ее синтеза, так и скоростью распада. Цитоплазматическая РНК, а больше чем на 90% это РНК рибосом, пополняется за счет экспорта из ядра, но усиление синтеза РНК в ядре для этого совсем не обязательно. В ядре существует «аварийный» запас готовых рибосом, которые могут экстренно выбрасываться в цитоплазму. Другими словами, существует определенная независимость процессов накопления и распада, синтеза и транспорта РНК. Следовательно, и регуляция их не может осуществляться каким-либо одним фактором, будь то вход Са2+ или активизации синаптических рецепторов.
То, что убедительно доказать правоту предлагаемой им схемы регуляции обмена РНК в нервных клетках не получалось, делало саму проблему неинтересной для Бориса Николаевича. А тут еще зарубежные коллеги подложили большую свинью. Сначала группой Peterson была опубликована работа, из которой следовало, что интенсивность включения меченого уридина в РНК при стимуляции нейронов критически зависит от концентрации предшественника в инкубационной среде. В их опытах стимуляция приводила к увеличению мечения РНК только тогда, когда уридина в среде было много, сотни микромолей. Затем вышла статья Wilson и Berry, где они честно написали, что тоже видели увеличение включения метки в РНК, только если кроме меченого уридина добавляли в среду еще и немеченый. Когда такой добавки не делали, стимуляция влияния на включение не оказывала. Мы работали только с низкими концентрациями уридина и наблюдали как активацию, так и подавление включения. Влияние транспорта уридина в клетки на включение метки в наших опытах удалось исключить, но серьезная неопределенность относительно использования добавленного и/или эндогенного уридина для синтеза оставалась. Во весь рост встал вопрос, насколько адекватно включение меченых предшественников отражает интенсивность синтеза РНК в нейронах моллюсков и клеточных системах вообще.
Мало того, Wilson и Berry проанализировали влияние синаптической стимуляции нейронов аплизии на синтез белков. Результат оказался неутешительным. По их данным, после стимуляции ни общее включение, ни распределение метки по фракциям белков разного молекулярного веса достоверно не менялось. В обзоре 1973 года, опубликованном в Progress in Neurobiology, Peterson подвел итог исследованиям влияния электрической активности на синтез РНК в гигантских нейронах моллюсков. По его мнению, поскольку изменений синтеза белков в теле этих нейронов после синаптической стимуляции найти не удалось, то и регистрируемые при определенных условиях сдвиги интенсивности мечения РНК физиологического значения не имеют и, скорее всего, являются артефактом.
Приговор был суров, он отражал сложившийся к тому времени идейный и методический кризис в разработке проблемы. Конечно, работа с идентифицируемыми клетками, с известной историей их функциональной активности существенно повысила уровень определенности, которого удалось добиться в определении параметров их метаболической реакции. Но для понимания механизмов сопряжения электрических процессов на наружной клеточной мембране и синтезов в ядре и цитоплазме этого оказалось недостаточно. Подход исчерпал себя. Не случайно, Борис Николаевич не написал на эту тему не только монографии, но даже обзора. Новый подъем интереса к проблеме приходится на 90-е годы, но базировался он на иной идеологии и других методических возможностях. Я бы сказала, что от цитологов и физиологов разработка проблемы перешла в руки молекулярных биологов.
СОВРЕМЕННЫЙ ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЙ РОЛИ КАЛЬЦИЯ
В РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА РНК И БЕЛКА В НЕРВНЫХ КЛЕТКАХ
За прошедшие 30 лет представления о роли Са2+ в жизнедеятельности клетки изменились принципиально. Когда Б.Н. Вепринцев развивал свою идею участия Са+2 в регуляции синтеза РНК, считалось, что Са2+ – это только один из токопереносящих ионов, для которого существуют каналы в наружной мембране, мембране саркоплазматического ретикулума и митохондрий. К началу 80-х на функции Са+2 смотрели уже шире. Академик П.Г. Костюк в одном из своих обзоров, посвященных изучению кальциевых токов, писал, что электрическое возбуждение тел нервных клеток, с точки зрения передачи информации от нейрона к нейрону, не имеет смысла. Спайк возникает в начальном сегменте аксона и распространяется по нему до синаптических контактов с другими нервными клетками. Распространение же ПД в обратном направлении, от аксонного холмика в сому нервных клеток – это своего рода информационный тупик. Он допускал, что смысл генерации ПД в соме может состоять именно в запуске метаболического ответа. Теперь же не вызывает сомнения, что Са2+ – это, прежде всего, один из основных регуляторов и интеграторов множества внутриклеточных процессов, и главная его функция сигнальная. Выявлены и хорошо изучены системы Са-зависимых протеинкиназ, известны их субстраты и механизмы регуляции активности. За прошедшие годы сформирована общая идеология каскадной передачи сигналов от клеточной мембраны в ядро при помощи вторичных и третичных посредников. Определена роль активации ранних генов как промежуточного звена для регуляции экспрессии структурных генов в ответ на сигналы с наружной мембраны. Установлена структура регуляторных локусов генов, известны способы влияния на их активность.
Когда-то мы имели дело с неким подобием черного ящика: на входе - стимуляция нейрона, на выходе – изменения ультраструктуры, количества и синтеза РНК. Что происходит между стимулом и метаболическим ответом, было совершенно непонятно. Высказывавшиеся тогда предположения о возможности действия Са+2 и/или медиаторов непосредственно на ДНК в ядре, с позиций сегодняшнего дня, не выдерживают критики. Для анализа состояния клеток мы использовали цитофотометрию, авторадиографию, электронную микроскопию. Соответственно, имели дело с набором интегральных показателей: общее количество РНК или белка, суммарное включение. За прошедшие годы, благодаря появлению новых методов (PCR, гибридизация in situ, иммуноблотинг и многие другие) изменился сам предмет исследования. Теперь есть возможность измерять в конкретных клетках уровень экспрессии конкретных генов, оценивать не просто содержание индивидуальных белков, но и их разнообразных посттрансляционных модификаций, например фосфорилированных и дефосфорилированных форм. Можно определить не только локализацию того или иного белка, но и отследить его перемещения в клетке. В целом, организация большинства внутриклеточных процессов уже хорошо изучена, основные участвующие в них белки определены, и доминирующая тенденция состоит в разборке механизма на все более и более мелкие детали. И, в соответствии с этой тенденцией, основной акцент в изучении участия Са2+ в регуляции синтезов сместился в область модуляции экспрессии конкретных генов. Что же удалось выяснить на этом этапе разработки проблемы? Во-первых, доказано, что Са2+, через запускаемые им сигнальные каскады, действительно может на уровне регуляции транскрипции ранних и структурных генов влиять на то, какие белки преимущественно синтезируются клеткой. Продемонстрирована Са-зависимая избирательная +/- регуляция экспрессии большого набора структурных генов. Такая регуляция осуществляется при участии кальмодулин-зависимых протеинкиназ, протеинкиназы С, инозитол-зависимых, МАРК и других киназ через чувствительные к сАМР (CREB) и сыворотке (SR) элементы промотеров ранних генов. Чрезвычайно важно, что регуляция действительно избирательная: одновременно экспрессия одних генов усиливается, других падает, остальных не меняется, а интегральная интенсивность синтеза мРНК при этом не меняется.
Во-вторых, главный камень преткновения в дискуссиях 70-х годов, вопрос о том спайковая или синаптическая активность определяет характер метаболи-ческой реакции нейронов, оказался вообще иллюзорным. Выяснилось, что активация самых распространенных в ЦНС позвоночных возбуждающих глютаматных синапсов приводит к значительным изменениям внутриклеточной концентрации Са2+, потому что основным токопереносящим ионом рецепторов глютамата является именно Са2+. А вот нервные клетки с чисто кальциевым механизмом генерации ПД встречаются нечасто. Даже среди нейронов моллюсков смешанный тип генерации ПД, одновременное присутствие и Са2+, и Na+ входящих токов, распространен больше. Что касается позвоночных, то ионный механизм генерации ПД у них меняется по мере созревания мозга. Когда у юных нейронов появляется спайковая активность, то ПД определяют Са2+ токи, позднее сочетание Са2+ и Na+ токов, а у абсолютного большинства зрелых нейронов только Na+ токи. Это, к стати, было хорошо известно и во времена дискуссий
70-х. Поэтому в одних случаях определяющим будет вход Са2+ через потенциало-зависимые каналы, в других поступление Са2+ через рецепторные каналы, а в-третьих через те и другие одновременно. Не менее вероятен и такой вариант, когда индуктором метаболического ответа будет совсем не вход Са2+ , а его внутриклеточное перераспределение, освобождение из ретикулума. Противопоставление спайковой и синаптической активности как регуляторов синтеза РНК и/или белка в нервных клетках утратило всякий смысл. Очевидно, что запуск метаболического ответа может происходить и при активации иных сигнальных систем. Нервные клетки слишком отличаются друг от друга по своим свойствам, чтобы закономерности, найденные для какого-либо одного конкретного типа нейронов, можно было бы сразу же обобщать до уровня общих правил. Именно поэтому так сложно увидеть общее за разнообразием частностей. Но, увы, грех влюбленности в свои, и только в свои результаты так распространен.
Борис Николаевич в своих построениях отталкивался от оценки возможных изменений концентрации Са2+, считая, что при генерации ПД идет его линейное накопление. Отсюда и его стремление найти пропорциональность ответной реакции частоте или числу ПД. За прошедшее с тех пор время стала очевидной вся сложность регуляции кальциевого гомеостаза в клетке. Измерены потоки Са2+, определены типы кальциевых каналов и их характеристики. Установлены параметры депонирования и освобождения Са2+ ретикулумом и митохондриями, связывания Са2+ цитоплазматическими белками. Изучены механизмы выведения Са2+из клеток. Теперь мы знаем, что распределение Са2+ в клетке может быть и неоднородным: концентрации Са2+в ядре и цитоплазме далеко не всегда совпадают, возможно его накопление в примембранной области. Поэтому ни о какой линейности накопления Са2+говорить не приходится, все оказалось много сложнее.
И вот самое удивительное, на мой взгляд, из того, что стало известно за последнее время о регуляции кальцием экспрессии РНК. Оказывается, что имеет значение не просто сколько Са2+ поступает в клетку, но и через какие «ворота», через потенциалозависимые каналы электрогенной мембраны или в результате активации хеморецептивной мембраны через каналы рецепторов глютамата. Вот только один пример. Вход Са2+ в нервную клетку при генерации ПД более эффективно стимулирует CRE-регулируемую экспрессию c-fos гена чем поступление Са2+ через синаптические NMDA глютаматные рецепторы. А для стимуляции того же гена c-fos через SRE элемент промотера значения не имеет, через какие каналы входит Са2+. Более того, показано, что на экспрессию конкретных генов влияет не просто средняя частота и длительность, а временной паттерн активности, то, как ПД и синаптические потенциалы группируются, какие между ними интервалы.Так, генерация пачек ПД нейронами дорзальных ганглиев в ответ на раздражение с частотой 10гц в течение 10 секунд и интервалом между стимулами 1мин активирует экспрессию c-fos гена в максимальной степени, причем быстро, уже в первые минуты стимуляции. Когда же интервалы между пачками ПД увеличивают, ответ уменьшается. При интервале в 5 мин даже 30-минутное раздражение уже не влияет на синтез мРНК для c-FOS белка (D. Fields et al.,1997). Согласно современным представлениям, через Са-зависимые сигнальные системы может осуществляться тонкая настройка программы синтеза белков на уровне транскрипции отдельных генов. При этом решающее значение имеют совсем не суммарные потоки, а динамика содержания и распределения Са2+ в клетке: где, как быстро, на какое время, с каким градиентом меняется его концентрация. Важно только помнить, что механизм кальциевой регуляции экспрессии генов отнюдь не является исключительной особенностью нервных клеток, механизм универсален и реализуется большинством клеток. К тому же это далеко не единственный способ сопряжения мембранных и внутриклеточных процессов.
Влияние Са2+ на внутриклеточные процессы, конечно же, не ограничивается модуляцией синтеза мРНК и, соответственно, конкретных белков. Общая интенсивность белкового синтеза тоже зависит от Са2+. В серии отличных работ D.BrÖstrÖm и его сотрудники показали, что существует довольно узкий диапазон концентраций Са2+ в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме, при которых в нервных клетках идет активный синтез белка. Поднимается концентрация Са2+ выше этого оптимума - синтез белка подавлен, падает ниже - трансляция практически останавливается. Наконец, существует еще одна точка приложения регулирующего действия Са2+ на белковый синтез. Это влияние потоков Са2+ на так называемый локальный синтез белка. Особенность локального синтеза состоит в преимущественном накоплении определенных мРНК в некоторых областях клетки, в результате чего нужные белки синтезируются непосредственно в месте их использования. В случае нервных клеток больше всего обсуждают возможную значимость локального синтеза белка в постсинаптических участках дендритов, там, где происходит накопление Са2+ в результате активации рецепторов медиаторов. Делается много спекуляций по поводу того, каким образом локальный синтез белка под влиянием Са2+ токов мог бы приводить к проявлениям структурной пластичности нейронов в форме изменений структуры синапсов, длины и ветвления дендритов.
